Western blot

Western blot

Es un metodo en biología utilizado para la detección de proteínas en una muestra de un tejido homogeneizado o extracto. Las proteínas son transferidas desde el gel hacia la membrana, donde son examinadas utilizando anticuerpos específicos para la proteína. El verbo blot en inglés significa manchar con tinta y el nombre Western (oeste, occidental) le fue dado por el investigador W. Neal Burnette (Analytical Biochemistry, 112:195-203, 1981) como un juego de palabras por los nombres Southern y Northern de las técnicas que se usan con el mismo fin pero se aplican a los ácidos nucleicos. Todo empezó cuando Edwin Southern. diseñó la técnica, que lleva su nombre, para detectar ADN, luego por oposición al punto cardinal Sur, se llamó Northen aplicada al ARN . Finalmente como una especie de broma la técnica de inmunoblotting (inmunotransferencia) para proteínas terminó siendo denominada Western.

A partir de virus purificado y tratado adecuadamente se puede correr un gel de proteínas (PAGE) en el que aparecerán las bandas correspondientes a las proteínas del virus .Recordemos que las proteínas primeramente se desnaturalizan con SDS y luego migran, por efecto de la aplicación de una corriente eléctrica, según su peso molecular.

Con EL SDS Las proteínas a analizar son hervidas a 100 ºC en presencia de un exceso de SDS y 2-mercaptoetanol. En esas condiciones el tiol rompe los puentes disulfuro que pudieran existir y el agente desnaturalizante hace que la proteína se desdoble en sus polipéptidos constitutivos, A causa de ello la carga intrínseca del péptido se hace insignificante ante el exceso de carga negativa del SDS; como consecuencia, la carga de todas las moléculas será prácticamente idéntica. Por lo que su desplazamiento en un campo eléctrico, en un gel de determinada porosidad, dependerá exclusivamente de su tamaño molecular.

Cuando termina la corrida se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y conservan la posición original que tenían en el gel. ¡De acuerdo a su peso molecular!

Luego la membrana se incuba (se pone en contacto), por ejemplo sumergiéndola, con una solución diluída del suero de una persona que se sospecha que pueda estar infectada. Luego de un tiempo, los anticuerpos contra las proteínas del virus van a reaccionar produciéndose la unión antígeno-anticuerpo

. Por ejemplo: si hay anticuerpos contra p24 en la banda donde se ubicó el antígeno o polipéptido p24 ahora también están los anticuerpos. Se hace luego un lavado de la tira, si los anticuerpos no están pegados se van con el lavado, los pegados quedan.