inhición de la hemaglutinación

Replicacion:

En la biblioteca hay un libro donde vienen esquemas por familia chequenlo haber si les sirve se llama "virus life in Diagrams"

Abigail

PRÁCTICA DE HEMAGLUTINACIÓN

membrana corioalantoidea

Diferencias de los virus con otros microorganismos

Diferencias de los virus con otros microorganismos

cuerpos de inclusión.

Cuerpos de inclusión
Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (VIH) y en otros como pequeñas vesículas.

Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto ( reovirus).

Cuerpos de Negri
Cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos que se encuentran en las células del sistema nervioso central en los enfermos de rabia.

TINCIÓN DE FEULGEN

La tinción de Feulgen es una técnica de tinción descubierta por Robert Feulgen y usada en histología para teñir selectivamente el material cromosómico o ADN en células. Depende de la hidrólisis ácida del ADN.
Esta técnica consiste en la hidrolización del DNA mediante una dilución débil de ácido clorhídrico que libera las bases púricas, quedando libres los radicales aldehídos de las pentosas, y en la coloración con leucofuscina, que pone de manifiesto los grupos aldehído.

Papanicolao

Tinción de Papanicolau: está particularmente indicada para el estudio de la queratinización de las células memalpighianas patológicas, infectadas con el virus del papiloma humano. Fue introducida por Papanicolau en 1925, es una tinción diferencial o policroma.

Usa tres colorantes básicos (o mezclas), el colorante nuclear en la hematoxilina de Harris que produce una impregnación excelente de la estructura cromatinica y también usa mezclas de color citoplasmático como el naranja G, verde luz, pardo Brismark, eosina…

La hematoxilina de Harris se usa sin acidificar con ácido acético y proporciona un color azul oscuro a los núcleos.

El naranja G junto con la solución eosina alcohólica (EA) constituye el colorante del citoplasma. Aunque la solución puede realizarse en el laboratorio se encuentra comercializada bajo el nombre de OG - G, tiñe de naranja los citoplasmas celulares que contienen queratina como por ejemplo las células del carcinoma epidermoide.

Las soluciones EA además de este colorante contiene verde luz y pardo Bismark.

Está técnica y tinción se utiliza para identificar el virus del papiloma humano.

Comercialmente se encuentran ya diluidos constituyendo las mezclas EA - 36, EA - SO y EA - &%, que si bien proporciona buenos resultados para cualquier muestra, en determinadas situaciones es recomendable el uso de alguna fórmula en particular. Este es el caso de algunas muestras ginecológicas con frecuencia gruesas donde es preferible emplear EA - 65 ya que al tener verde luz no colorea tan intensamente el fondo de la preparación, además el empleo de esta mezcla facilita la distinción entre adenocarcinoma de cerviz (citoplasma rosáceo) y adenocarcinoma endometrial (citoplasma azulado).

NARANJA DE ACRIDINA

Principio
El anaranjado de acridina se usa como colorante fluorescente para diferenciar ADN y ARN. Existen además numerosos procedimientos de tinción para visualizar estructuras ricas en ADN y ARN. El anaranjado de acridina se puede
usar también para tinción de microorganismos en muestras no fijadas y para tinciones vitales.

El Naranja de acridina (o N,N,N',N'-tetrametilacridina según IUPAC) es un colorante catiónico selectivo para los ácidos nucléicos y útil para realizar determinaciones sobre el ciclo celular. Interacciona con el ADN y el ARN por intercalación dentro de la molécula o por atracción electrostática, respectivamente. Cuando asociado al ADN, el naranja de acridina es espectralmente similar a la fluoresceína, presentado un máximo de excitación a 502 nm y una emisión a 525 nm (en el verde). Cuando está asociado al ARN, la excitación máxima deriva a 460 nm (en el azul) y la emisión máxima a 650 nm (en el rojo). Por lo tanto, este colorante tiñe de verde a las células en fase de división activa (mucho ADN), y de naranja a las que están en reposo multiplicativo (mucho ARN y proteínas). El colorante se utiliza frecuentemente en microscopía de epifluorescencia. Se lo prepara a partir del aceite de creosota y del alquitrán de hulla. Se lo utiliza conjuntamente con el bromuro de etidio para diferenciar entre células vivas y apoptóticas. El naranja de acridina es además un mutágeno que tiende a producir mutaciones de desplazamiento del marco de lectura.
El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción.

El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos positivos.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 2 aumentos comparados con los de los mejores microscopios ópticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles".
Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido.
Microscopio electrónico de transmisión
El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto cuya imagen se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar la imagen de un objeto hasta un millón de veces.
Microscopio electrónico de barrido
En el microscopio electrónico de barrido la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie.

Métodos de microscopía electrónica aplicados a Ia Virología:
tinción negativa
citoquímica e inmunohistoquímica ultraestructural
inmuno-microscopía electrónica

o Se pueden aplicar numerosas técnicas de microscopía electrónica para observar virus. Pero en los análisis de rutina, para detectar y cuantificar virus sólo se emplean los métodos más sencillos. Los más complejos (inclusión en resinas, cortes), sólo se usan en investigación.
 Tinción negativa. Consiste en mezclar una suspensión donde suponemos que están los virus, con una sal densa a los electrones, p. ej. acetato de uracilo, fosfotungstato potásico (ác. fosfotungstico). Esta mezcla se deposita en una rejilla de microscopía electrónica y se observa al microscopio electrónico de transmisión. Con esta técnica, los virus no se tiñen en realidad, sino que lo que se tiñe es el medio. Esta es la más usada porque es la más sencilla.
 Sombreado. Consiste en depositar a los virus sobre una rejilla y hacer incidir sobre la misma un metal, normalmente platino, con un cierto ángulo, respecto a la rejilla. El platino, cubre a los virus, pero queda en un lado una sombra de color claro (el platino queda oscuro). Entonces al observar la rejilla, se verán los virus oscuros y la sombra clara. Entonces se observa una imagen de aspecto tridimensional.
Mediante estas dos técnicas, se puede demostrar la presencia de virus en una muestra, pero también se pueden contar, por un procedimientos especial.

DOT BLOT

Es un ELISA directo que utiliza como soporte solido papel de nitrocelulosa. El antigeno (recombinante o sintético), en general se absorbe pasivamente en forma de gota.
Estas pruebas son faciles de realizar, rápidas, la mayoria arrojan datos en pocos minutos, pero son costosas. En general se utilizan conjugados de anti-inmunoglobulinas ligados a una enzima que se fijan al anticuerpo del paciente. La adición de sustratos + cromogeno permite la visualización del color en el papel.
Dot blot es más especifico que ELISA.


Nota: Resultado (+): en gota (dot blot), o en una zona alargada (slot blot).

Western blot

Western blot

Es un metodo en biología utilizado para la detección de proteínas en una muestra de un tejido homogeneizado o extracto. Las proteínas son transferidas desde el gel hacia la membrana, donde son examinadas utilizando anticuerpos específicos para la proteína. El verbo blot en inglés significa manchar con tinta y el nombre Western (oeste, occidental) le fue dado por el investigador W. Neal Burnette (Analytical Biochemistry, 112:195-203, 1981) como un juego de palabras por los nombres Southern y Northern de las técnicas que se usan con el mismo fin pero se aplican a los ácidos nucleicos. Todo empezó cuando Edwin Southern. diseñó la técnica, que lleva su nombre, para detectar ADN, luego por oposición al punto cardinal Sur, se llamó Northen aplicada al ARN . Finalmente como una especie de broma la técnica de inmunoblotting (inmunotransferencia) para proteínas terminó siendo denominada Western.

A partir de virus purificado y tratado adecuadamente se puede correr un gel de proteínas (PAGE) en el que aparecerán las bandas correspondientes a las proteínas del virus .Recordemos que las proteínas primeramente se desnaturalizan con SDS y luego migran, por efecto de la aplicación de una corriente eléctrica, según su peso molecular.

Con EL SDS Las proteínas a analizar son hervidas a 100 ºC en presencia de un exceso de SDS y 2-mercaptoetanol. En esas condiciones el tiol rompe los puentes disulfuro que pudieran existir y el agente desnaturalizante hace que la proteína se desdoble en sus polipéptidos constitutivos, A causa de ello la carga intrínseca del péptido se hace insignificante ante el exceso de carga negativa del SDS; como consecuencia, la carga de todas las moléculas será prácticamente idéntica. Por lo que su desplazamiento en un campo eléctrico, en un gel de determinada porosidad, dependerá exclusivamente de su tamaño molecular.

Cuando termina la corrida se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y conservan la posición original que tenían en el gel. ¡De acuerdo a su peso molecular!

Luego la membrana se incuba (se pone en contacto), por ejemplo sumergiéndola, con una solución diluída del suero de una persona que se sospecha que pueda estar infectada. Luego de un tiempo, los anticuerpos contra las proteínas del virus van a reaccionar produciéndose la unión antígeno-anticuerpo

. Por ejemplo: si hay anticuerpos contra p24 en la banda donde se ubicó el antígeno o polipéptido p24 ahora también están los anticuerpos. Se hace luego un lavado de la tira, si los anticuerpos no están pegados se van con el lavado, los pegados quedan.

mas del acido nitroso

En soluciones acuosas, el ácido nitroso (HNO2) desamina oxidativamente las aminas primarias aromáticas, de tal forma que convierte la citosina en uracilo Y adenina en la molécula parecida a la guanina, la hipoxantina (que forma dos de los tres enlaces de la guanina con la citosina)

Efecto de la hipoxantina como mutágeno
De tal forma que el tratamiento del ADN con el HNO2 o compuestos como las nitrosaminas que reaccionan para formar ácido nítrico, resulta en ambas transiciones A•T – G•C y G•C – A•T

AGLUTINACION

Cuando la acción del anticuerpo está dirigida a antígenos que están en la superficie o forman parte de la membrana de un microorganismo o de una célula, el anticuerpo produce una agregación, dando lugar a un fenómeno visible llamado aglutinación. Esta reacción se hace visible por las partículas de latex. Las células recubiertas con partículas de virus pueden ser aglutinadas por anticuerpos contra estos virus. Igualmente pueden emplearse para detectar virus que estén en células infectadas, ya que los anticuerpos contra estos virus producirán la aglutinación de las células, debido a la expresión de antígenos víricos en sus membranas.

La aglutinación se lleva a cabo en solución ≥ 0.15 M de NaCl. Aunque la superficie de las partículas posea anticuerpos, es posible que la aglutinación no se produzca en caso de que la concentración salina sea excesivamente baja.

El las reacciones de aglutinación sólo interaccionan antígenos superficiales y no los citoplasmáticos, dado a que es imposible que los Ac penetren en el interior de las células.

Placas líticas

Método de Plaqueo

Este método consiste en infectar un cultivo celular y agregar el medio nutritivo del mismo en fase semisólida (agar, agarosa, carboximetilcelulosa, metilcelulosa). De esta manera, cuando un virus infecta una célula, su progenie sólo puede migrar a las células inmediatamente vecinas, y no a las alejadas, ya que el medio semisólido limita su movilidad. Coloreando las células se observarán zonas no teñidas (placas de lisis), correspondientes a las células destruídas por la partícula infecciosa inoculada y las nuevas partículas que ella produjo (Fig.4). si la coloración se realiza con un colorante vital (rojo neutro), que no mata las células teñidas ni al virus, es posible tomar material de una placa, que contendrá la progenie viral correspondiente a un único virus infectante, constituyendo, por lo tanto, un “clon”.

El título de la preparación viral se calcula contando el número de placas que produce una determinada dilución de la muestra, y haciendo las correcciones necesarias para llegar a la cantidad de virus en la muestra original. Cada partícula infecciosa da origen a una placa de lisis, y se denomina en este caso "Unidad Formadora de Placa" (UFP). El título se expresa como "UFP/ml" o "UFP/g", según corresponda.

Por ejemplo: Supongamos que la inoculación de 0,2 ml de una dilución 1:1000 de una suspensión viral produce 84 placas de lisis en un cultivo celular. Esto es equivalente a decir que en ese volumen de esa dilución hay 84 UFP. Debemos expresar el título en "UFP/ml".

0,2 ml = 84 UFP

1 ml = (84 UFP x 1 ml): 0,2 ml= 420 UFP

Son 420 UFP/ml en la muestra diluída 1:1000, por lo tanto la muestra original tiene

420 x 1000 UFP/ml.

En notación científica:

4,2 x 10⁵ UFP/ml.

Alejandra Sánchez Barrera