USO DE CULTIVOS CELULARES EN VIROLOGÍA
MÉTODOS DE PROPAGACIÓN
Para aislar, caracterizar, identificar virus y producir vacunas se requieren altas cantidades de virus:
• Animales:
- Propagación viral en organismos susceptibles sanos.
- Es limitado por razones éticas.
- Se obtienen virus que no son fácilmente obtenidos en cultivos
Propósitos diagnósticos, inoculación de animales para detectar virus en pruebas clínicas, tales como: inoculación del virus de la rabia en ratones lactantes
• Huevos Embrionados:
- Primer método utilizado para la propagación de virus en tejidos animales; previo a cultivos de células y tejidos.
- Utilizado para propagación de virus de aves.
- Utilizado para atenuar virus de vacunas a virus vivo modificado.
• Cultivo de Células/Tejidos:
- Para el crecimiento y mantenimiento de células tisulares in vitro.
- Explante celular
- Cultivo celular
POR QUÉ CULTIVAR CELULAS?
• Estudio de las células: crecimiento, qué necesitan, cómo y cuando dejan de crecer.
• Estudios sobre ciclo celular, control del crecimiento de células tumorales y modulación de la expresión genética.
Reproducción: estudio del desarrollo y diferenciación
DEFINICIÓN
Los cultivos de células in vitro consisten en un sistema formado por células provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composición química definida y en condiciones de temperatura, pH, aireación y humedad controladas.
Los cultivos celulares son los más ampliamente utilizados para el trabajo con virus.

TIPOS DE CULTIVOS CELULARES
• Adherentes: monocapa
• No adherentes: suspensión.
TIPOS DE CULTIVOS CELULARES
• Explante celular: fragmento de tejido que se mantiene en cultivo.
• Cultivo Primario: derivado de tejido fresco sometido a enzimas para obtener células individuales.
– División a baja frecuencia
– Tiempo de vida alto, lo que los hace ideales para el aislamiento de virus.
Soportan hasta 20 pasajes in vitro
CULTIVO PRIMARIO
• Aislamiento a partir de sangre completa, órganos (hígado, corazón o riñón) u organismos completos (embriones de pollo).
• En esta práctica aislaremos fibroblastos a partir de EP de 10 días
• A pie de mechero desinfectamos el cascarón del EP con alcohol al 70%
• Por la cámara de aire tomamos al embrión de pollo sujetándolo con una pinza o clip estéril por el cuello
• Separamos del embrión cabeza y apéndice dejando solamente el tórax y abdomen
• Para macerar al embrión lo metemos en una jeringa de 10ml retirando previamente el émbolo.
• Al colocar el émbolo nuevamente ejercemos fuerza para que el embrión sea macerado por completo,
• Todo el embrión será depositado en un matraz con una mosca de agitación y 5 ml de una solución tibia de tripsina al 0.025% para disgregar todas las células del embrión durante 5 minutos
Preparación de la solución de tripsina
• Solución comercial de tripsina al 0.5% en PBS
• Diluir 1:1 esta solución con PBS esterilizado por filtración, solución de trabajo con tripsina al 0.25%
• Ejemplo: 25 ml de tripsina 0.5% + 25 ml de PBS
Preparación del cultivo celular
• Adicionar al matraz 2ml de PBS,
• Centrifugar de 1500-2000 RPM durante 5 minutos
• Decantar y resuspender la pastilla en 2ml de medio de crecimiento, en caso de que haya muchos detritus celulares pasar el macerado por un tamiz

• De organza para evitar que se formen cúmulos de tejido que atrapan células e impiden que se forme la monocapa.
• Depositar el filtrado en la botella de cultivo en condiciones de esterilidad
• Agregar 5ml del medio de crecimiento
• Poner las botellas en posición horizontal con la boca angulada hacia arriba en la estufa de incubación a 37°C.
• No mover la botella para promover la formación de la monocapa
Vigilar el crecimiento de las células cada 2 horas.
CONDICIONES FISICOQUIMICAS
El pH óptimo de crecimiento es de 7.4
El indicador de pH es rojo de fenol.
El medio de cultivo debe estar tamponado con buffer de carbonatos (HEPES); ya que equilibra el CO2 del medio, tiene un bajo costo, baja toxicidad
Osmolaridad
Rango 260 a 320 mOsm/kg
Humedad proporcionada por incubadoras
Temperatura
Tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células.
El rango es de 36° a 38°C.
Si aumenta a 42°C las células duran de 12-24 hrs.
Si aumenta a 45°C duran 1 hr.
Es necesario realizar pases para poder hacer crecer a las células que no murieron
CONDICIONES FISIOLOGICAS
GLUCOSA: Metabolizada por glucólisis hacia piruvato que puede ser convertido en lactato o acetoacetato que entra el ciclo de Krebs, y genera CO2.
Iones inorgánicos: Na, K, Ca, Mg, Fe, PO4, SO4, CO3.
Fuente de aminoácidos: Glutamato.
Vitaminas del complejo B.
Proteínas y péptidos proporcionados por suero fetal bovino
Suero de ternera ("calf serum", CF).
Suero fetal bovino ("fetal calf serum", FCS).
Suero de caballo ("horse serum", HS).
Suero humano ("human serum", HuS).
PREPARACIÓN DE MEDIOS
• Medio que contiene nutrientes mínimos tamponado e isotónico, contiene sales inorgánicas, fuente de energía y aminoácidos, pH 7.2 - 7.4
– Hepes y/o bicarbonato según ambiente (CO2)‏
– Vitaminas
– Aminoácidos no esenciales y L-Glutamina
– Ca y Mg
– P/S, Anfotericina (2% en medio de transporte)‏
– Glucosa o piruvato
• Suplementos: suero fetal bovino o un sustituto.
TIPOS DE MEDIOS
• Medio Basal de Eagle: células adherentes (monocapa), HeLa.
• Medio Eagle Modificado: Adición de vitaminas y aminoácidos. Células de embrión de ratón, líneas celulares adherentes de mamífero.
• Medio Esencial Mínimo: Células de mamíferos adherentes con mayores exigencias. También líneas celulares.
• RPMI 1640: Células en suspensión que requieren poco calcio. Leucocitos humanos o de ratones normales y neoplásicos.
• Adición de glutamina (carbono, energía).
• Algunos medios como DMEM necesitan de vigilancia continua de la concentración de CO2 con el objeto de que el pH no pase de 7.4
Preparación del medio DMEM
• Se utilizan botellas de 100ml estériles y nuevas de preferencia.
• Todo material de transferencia que se utilice de preferencia debe ser nuevo, desechable y estéril
• Debe utilizarse de ser necesario agua desionizada, esterilizada por filtración.
• Una vez preparado el medio se puede refrigerar a 4°C por un mes aproximadamente
• Si no se utiliza se alicuota y se congela hasta por un año
• Medio mínimo de Eagle por Dulbecco, formulación de alta glucosa (Invitrogen),
• Contenido :
• 5%, 10%, o 20% (v/v) suero fetal bovino
• 1% (v/v) aminoácidos no esenciales
• 2 mM L-glutamine
• 100 U/ml penicilina
• 100 μg/ml sulfato de streptomicina
• Filtrar y guardar a 4°C
Pase celular
• Un cultivo celular primario es mantenido en la botella hasta que éste alcanza confluencia (las células se encuentran unidas entre si, pegadas al piso de la botella y con la morfología de su estirpe celular
• Los fibroblastos son ahusados
• Cultivos semicontinuos: Células diploides
- Cultivos primarios que tienen células que pueden ser alimentadas con contenido genético idéntico al del organismo de donde provienen.
- Tienden a morir entre el 30 y 50 pases in vitro.
- Usados para propagación de un amplio rango de virus.
- Usualmente son del tipo de fibroblastos.
Cultivo Celular Continuo: Heteroploides.
Derivados de tejidos normales o neoplásicos.
La mayoría de los laboratorios de virología congelan stocks tempranos.
Las líneas en pases continuos pueden cambiar sus características celulares y su contenido genético
Las causas de los cambios en las características celulares pueden ser debidas a la infección con micoplasma spp o a virus contaminantes (Circovirus porcino o virus de diarrea viral bovina).
Metodología de pase celular
• La botella deberá estar en posición horizontal
• Es necesario lavar las células adheridas con PBS.
• Añadir 1 ml de tripsina 0.025% a 37°C durante 2 minutos máximo
• Recolectar el líquido en un tubo o dos con cantidades iguales, añadir PBS y centrifugar a 1500 RPM durante 5 minutos. Decantar
• Resuspender la pastilla en el líquido que quedo en el tubo agitandolo suavemente
• Añadir 1ml de medio de crecimiento lentamente para evitar la formación de grumos, si se forman retirarlos con una pipeta estéril.
• Vaciar las células en la botella de cultivo nueva, note que en este paso se pierde una cantidad de células por lo que se hace una dilución no intencionada.
• Añadir 5ml de medio de crecimiento y poner la botella en la estufa de incubación a 37° C es importante cuidar que el medio no vire a amarillo ya que el lactato mata a las células en crecimiento
INFECCIÓN DE UN CULTIVO CELULAR
PRECAUCIONES BÁSICAS
• Bioseguridad.
• Siempre utilizar bata de laboratorio.
• Utilizar guantes.
• Cuidado con objetos cortopunzantes contaminados.
• Eliminación de líquidos y sólidos.
• Utilizar solución de hipoclorito 5000 ppm
AISLAMIENTO VIRAL
 Brinda la posibilidad de caracterización del virus en detalle con las siguientes desventajas:
 Debe realizarse solo en el período agudo de la enfermedad
 Requiere días o semanas para la obtención del resultado
 Requiere niveles de seguridad 2, 3 o 4
 Frecuentemente tienen baja sensibilidad lo que depende en gran medida de la condición de la muestra
 Susceptible de contaminación bacteriana
 Susceptible de sustancias tóxicas que pueden estar presentes en la muestra
AISLAMIENTO VIRAL EN CELULAS C6/36
MONOCAPA DE CELULAS C6/36 NO INFECTADAS

MONOCAPA DE CELULAS C6/36 INFECTADAS: EFECTO CITOPÁTICO

Metodología de Infección de cultivo celular
• Para poder infectar un cultivo la monocapa dabe estar formada y las células deben tener la forma de su estirpe.
• Desechar el medio de cultivo por el lado contrario a la monocapa.
• En caso de tener demasiada suspensión lavar con PBS.
• Tomar un inoculo de 0.1ml de la vacuna y gotearlo sin tocar las paredes de la botella.
• Colocar la botella en forma horizontal en la mesa.
• Incubar 30 min 37°C
• Agregar 5 ml medio de mantenimento.
Observar al microscopio invertido
VISUALIZACIÓN DE VIRUS
• Microscopía de luz
- Utilizada para observar los efectos de la infección viral sobre la célula hospedera.
- Redondeamiento y agregados celulares, lisis, encogimiento , producción alta de detritos celulares; inflamación; formación de sincitios; cuerpos de inclusión.
• Microscopía de fluorescencia
- Visualización de células o tejidos infectados con virus, usando un anticuerpo marcado con un fluorocromo específico del antígeno.
- Visualización indirecta utilizando anticuerpos sin marcar (suero convaleciente) y luego un anti-anticuerpo marcado con un fluorocromo.
• Microscopía Electrónica
- Permite visualizar polímeros como DNA, RNA y proteínas.
- Permite visualizar imágenes de viriones en tres dimensiones y su localización en la célula hospedera
• Microscopía Inmuno-Electrónica
- Permite la visualización de complejos antígeno-anticuerpo específicos para un virus en particular

EFECTO CITOPÁTICO









Formación de Sincitios en cultivo celular por Virus respiratorio Sincicial y Sarampión.







HEMADSORCIÓN
Formación de sincitios causado por el Virus de paperas y Hemoadsorción de GR sobre la superficie del cultivo celular.









DESVENTAJAS DE CULTIVOS CELULARES
• Largo periodo de tiempo para obtener resultados.
• Algunas veces baja sensibilidad.
• Susceptible a contaminación bacterial.
• Susceptible a sustancias tóxicas.
• Muchos virus no crecen en cultivos celulares: Hepatitis B y C, papilomavirus.
• No es lo mismo que enfrentar el virus a un organismo completo
Conteo celular
• Cuando hacemos pase celular o cuando vamos a congelar células para poder utilizarlas posteriormente contamos nuestras células viables con el fin de preparar alícuotas que contengan de 500,000 a 1 millón de células dependiendo que vamos a hacer con ellas.


Congelación
• La congelación comprende desde -20°C para poder usar las células dentro de la primera semana después de la congelación
• Para congelar a menor temperatura se utilizan crioviales los cuales deben estar perfectamente sellados ya que cualquier líquido que se meta al vial compromete el proceso y la vida de la célula Se congelan células viables en medio enriquecido DMEM o RPMI
• Se adiciona dimetil sulfóxido (DMSO) como criopreservador
• Los criotubos se sumergen en alcohol isopropílico por una hora y se mete al congelador a -70°C
• De ahí se pasa al nitrógeno en donde pueden estar por meses de esta manera promovemos la formación de cristales pequeños.
• Este tren de congelación debe respetarse, de no ser así formarían cristales grandes dentro de la célula y la romperían