USO DE CULTIVOS CELULARES EN VIROLOGÍA
MÉTODOS DE PROPAGACIÓN
Para aislar, caracterizar, identificar virus y producir vacunas se requieren altas cantidades de virus:
• Animales:
- Propagación viral en organismos susceptibles sanos.
- Es limitado por razones éticas.
- Se obtienen virus que no son fácilmente obtenidos en cultivos
Propósitos diagnósticos, inoculación de animales para detectar virus en pruebas clínicas, tales como: inoculación del virus de la rabia en ratones lactantes
• Huevos Embrionados:
- Primer método utilizado para la propagación de virus en tejidos animales; previo a cultivos de células y tejidos.
- Utilizado para propagación de virus de aves.
- Utilizado para atenuar virus de vacunas a virus vivo modificado.
• Cultivo de Células/Tejidos:
- Para el crecimiento y mantenimiento de células tisulares in vitro.
- Explante celular
- Cultivo celular
POR QUÉ CULTIVAR CELULAS?
• Estudio de las células: crecimiento, qué necesitan, cómo y cuando dejan de crecer.
• Estudios sobre ciclo celular, control del crecimiento de células tumorales y modulación de la expresión genética.
Reproducción: estudio del desarrollo y diferenciación
DEFINICIÓN
Los cultivos de células in vitro consisten en un sistema formado por células provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composición química definida y en condiciones de temperatura, pH, aireación y humedad controladas.
Los cultivos celulares son los más ampliamente utilizados para el trabajo con virus.

TIPOS DE CULTIVOS CELULARES
• Adherentes: monocapa
• No adherentes: suspensión.
TIPOS DE CULTIVOS CELULARES
• Explante celular: fragmento de tejido que se mantiene en cultivo.
• Cultivo Primario: derivado de tejido fresco sometido a enzimas para obtener células individuales.
– División a baja frecuencia
– Tiempo de vida alto, lo que los hace ideales para el aislamiento de virus.
Soportan hasta 20 pasajes in vitro
CULTIVO PRIMARIO
• Aislamiento a partir de sangre completa, órganos (hígado, corazón o riñón) u organismos completos (embriones de pollo).
• En esta práctica aislaremos fibroblastos a partir de EP de 10 días
• A pie de mechero desinfectamos el cascarón del EP con alcohol al 70%
• Por la cámara de aire tomamos al embrión de pollo sujetándolo con una pinza o clip estéril por el cuello
• Separamos del embrión cabeza y apéndice dejando solamente el tórax y abdomen
• Para macerar al embrión lo metemos en una jeringa de 10ml retirando previamente el émbolo.
• Al colocar el émbolo nuevamente ejercemos fuerza para que el embrión sea macerado por completo,
• Todo el embrión será depositado en un matraz con una mosca de agitación y 5 ml de una solución tibia de tripsina al 0.025% para disgregar todas las células del embrión durante 5 minutos
Preparación de la solución de tripsina
• Solución comercial de tripsina al 0.5% en PBS
• Diluir 1:1 esta solución con PBS esterilizado por filtración, solución de trabajo con tripsina al 0.25%
• Ejemplo: 25 ml de tripsina 0.5% + 25 ml de PBS
Preparación del cultivo celular
• Adicionar al matraz 2ml de PBS,
• Centrifugar de 1500-2000 RPM durante 5 minutos
• Decantar y resuspender la pastilla en 2ml de medio de crecimiento, en caso de que haya muchos detritus celulares pasar el macerado por un tamiz

• De organza para evitar que se formen cúmulos de tejido que atrapan células e impiden que se forme la monocapa.
• Depositar el filtrado en la botella de cultivo en condiciones de esterilidad
• Agregar 5ml del medio de crecimiento
• Poner las botellas en posición horizontal con la boca angulada hacia arriba en la estufa de incubación a 37°C.
• No mover la botella para promover la formación de la monocapa
Vigilar el crecimiento de las células cada 2 horas.
CONDICIONES FISICOQUIMICAS
El pH óptimo de crecimiento es de 7.4
El indicador de pH es rojo de fenol.
El medio de cultivo debe estar tamponado con buffer de carbonatos (HEPES); ya que equilibra el CO2 del medio, tiene un bajo costo, baja toxicidad
Osmolaridad
Rango 260 a 320 mOsm/kg
Humedad proporcionada por incubadoras
Temperatura
Tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células.
El rango es de 36° a 38°C.
Si aumenta a 42°C las células duran de 12-24 hrs.
Si aumenta a 45°C duran 1 hr.
Es necesario realizar pases para poder hacer crecer a las células que no murieron
CONDICIONES FISIOLOGICAS
GLUCOSA: Metabolizada por glucólisis hacia piruvato que puede ser convertido en lactato o acetoacetato que entra el ciclo de Krebs, y genera CO2.
Iones inorgánicos: Na, K, Ca, Mg, Fe, PO4, SO4, CO3.
Fuente de aminoácidos: Glutamato.
Vitaminas del complejo B.
Proteínas y péptidos proporcionados por suero fetal bovino
Suero de ternera ("calf serum", CF).
Suero fetal bovino ("fetal calf serum", FCS).
Suero de caballo ("horse serum", HS).
Suero humano ("human serum", HuS).
PREPARACIÓN DE MEDIOS
• Medio que contiene nutrientes mínimos tamponado e isotónico, contiene sales inorgánicas, fuente de energía y aminoácidos, pH 7.2 - 7.4
– Hepes y/o bicarbonato según ambiente (CO2)‏
– Vitaminas
– Aminoácidos no esenciales y L-Glutamina
– Ca y Mg
– P/S, Anfotericina (2% en medio de transporte)‏
– Glucosa o piruvato
• Suplementos: suero fetal bovino o un sustituto.
TIPOS DE MEDIOS
• Medio Basal de Eagle: células adherentes (monocapa), HeLa.
• Medio Eagle Modificado: Adición de vitaminas y aminoácidos. Células de embrión de ratón, líneas celulares adherentes de mamífero.
• Medio Esencial Mínimo: Células de mamíferos adherentes con mayores exigencias. También líneas celulares.
• RPMI 1640: Células en suspensión que requieren poco calcio. Leucocitos humanos o de ratones normales y neoplásicos.
• Adición de glutamina (carbono, energía).
• Algunos medios como DMEM necesitan de vigilancia continua de la concentración de CO2 con el objeto de que el pH no pase de 7.4
Preparación del medio DMEM
• Se utilizan botellas de 100ml estériles y nuevas de preferencia.
• Todo material de transferencia que se utilice de preferencia debe ser nuevo, desechable y estéril
• Debe utilizarse de ser necesario agua desionizada, esterilizada por filtración.
• Una vez preparado el medio se puede refrigerar a 4°C por un mes aproximadamente
• Si no se utiliza se alicuota y se congela hasta por un año
• Medio mínimo de Eagle por Dulbecco, formulación de alta glucosa (Invitrogen),
• Contenido :
• 5%, 10%, o 20% (v/v) suero fetal bovino
• 1% (v/v) aminoácidos no esenciales
• 2 mM L-glutamine
• 100 U/ml penicilina
• 100 μg/ml sulfato de streptomicina
• Filtrar y guardar a 4°C
Pase celular
• Un cultivo celular primario es mantenido en la botella hasta que éste alcanza confluencia (las células se encuentran unidas entre si, pegadas al piso de la botella y con la morfología de su estirpe celular
• Los fibroblastos son ahusados
• Cultivos semicontinuos: Células diploides
- Cultivos primarios que tienen células que pueden ser alimentadas con contenido genético idéntico al del organismo de donde provienen.
- Tienden a morir entre el 30 y 50 pases in vitro.
- Usados para propagación de un amplio rango de virus.
- Usualmente son del tipo de fibroblastos.
Cultivo Celular Continuo: Heteroploides.
Derivados de tejidos normales o neoplásicos.
La mayoría de los laboratorios de virología congelan stocks tempranos.
Las líneas en pases continuos pueden cambiar sus características celulares y su contenido genético
Las causas de los cambios en las características celulares pueden ser debidas a la infección con micoplasma spp o a virus contaminantes (Circovirus porcino o virus de diarrea viral bovina).
Metodología de pase celular
• La botella deberá estar en posición horizontal
• Es necesario lavar las células adheridas con PBS.
• Añadir 1 ml de tripsina 0.025% a 37°C durante 2 minutos máximo
• Recolectar el líquido en un tubo o dos con cantidades iguales, añadir PBS y centrifugar a 1500 RPM durante 5 minutos. Decantar
• Resuspender la pastilla en el líquido que quedo en el tubo agitandolo suavemente
• Añadir 1ml de medio de crecimiento lentamente para evitar la formación de grumos, si se forman retirarlos con una pipeta estéril.
• Vaciar las células en la botella de cultivo nueva, note que en este paso se pierde una cantidad de células por lo que se hace una dilución no intencionada.
• Añadir 5ml de medio de crecimiento y poner la botella en la estufa de incubación a 37° C es importante cuidar que el medio no vire a amarillo ya que el lactato mata a las células en crecimiento
INFECCIÓN DE UN CULTIVO CELULAR
PRECAUCIONES BÁSICAS
• Bioseguridad.
• Siempre utilizar bata de laboratorio.
• Utilizar guantes.
• Cuidado con objetos cortopunzantes contaminados.
• Eliminación de líquidos y sólidos.
• Utilizar solución de hipoclorito 5000 ppm
AISLAMIENTO VIRAL
 Brinda la posibilidad de caracterización del virus en detalle con las siguientes desventajas:
 Debe realizarse solo en el período agudo de la enfermedad
 Requiere días o semanas para la obtención del resultado
 Requiere niveles de seguridad 2, 3 o 4
 Frecuentemente tienen baja sensibilidad lo que depende en gran medida de la condición de la muestra
 Susceptible de contaminación bacteriana
 Susceptible de sustancias tóxicas que pueden estar presentes en la muestra
AISLAMIENTO VIRAL EN CELULAS C6/36
MONOCAPA DE CELULAS C6/36 NO INFECTADAS

MONOCAPA DE CELULAS C6/36 INFECTADAS: EFECTO CITOPÁTICO

Metodología de Infección de cultivo celular
• Para poder infectar un cultivo la monocapa dabe estar formada y las células deben tener la forma de su estirpe.
• Desechar el medio de cultivo por el lado contrario a la monocapa.
• En caso de tener demasiada suspensión lavar con PBS.
• Tomar un inoculo de 0.1ml de la vacuna y gotearlo sin tocar las paredes de la botella.
• Colocar la botella en forma horizontal en la mesa.
• Incubar 30 min 37°C
• Agregar 5 ml medio de mantenimento.
Observar al microscopio invertido
VISUALIZACIÓN DE VIRUS
• Microscopía de luz
- Utilizada para observar los efectos de la infección viral sobre la célula hospedera.
- Redondeamiento y agregados celulares, lisis, encogimiento , producción alta de detritos celulares; inflamación; formación de sincitios; cuerpos de inclusión.
• Microscopía de fluorescencia
- Visualización de células o tejidos infectados con virus, usando un anticuerpo marcado con un fluorocromo específico del antígeno.
- Visualización indirecta utilizando anticuerpos sin marcar (suero convaleciente) y luego un anti-anticuerpo marcado con un fluorocromo.
• Microscopía Electrónica
- Permite visualizar polímeros como DNA, RNA y proteínas.
- Permite visualizar imágenes de viriones en tres dimensiones y su localización en la célula hospedera
• Microscopía Inmuno-Electrónica
- Permite la visualización de complejos antígeno-anticuerpo específicos para un virus en particular

EFECTO CITOPÁTICO









Formación de Sincitios en cultivo celular por Virus respiratorio Sincicial y Sarampión.







HEMADSORCIÓN
Formación de sincitios causado por el Virus de paperas y Hemoadsorción de GR sobre la superficie del cultivo celular.









DESVENTAJAS DE CULTIVOS CELULARES
• Largo periodo de tiempo para obtener resultados.
• Algunas veces baja sensibilidad.
• Susceptible a contaminación bacterial.
• Susceptible a sustancias tóxicas.
• Muchos virus no crecen en cultivos celulares: Hepatitis B y C, papilomavirus.
• No es lo mismo que enfrentar el virus a un organismo completo
Conteo celular
• Cuando hacemos pase celular o cuando vamos a congelar células para poder utilizarlas posteriormente contamos nuestras células viables con el fin de preparar alícuotas que contengan de 500,000 a 1 millón de células dependiendo que vamos a hacer con ellas.


Congelación
• La congelación comprende desde -20°C para poder usar las células dentro de la primera semana después de la congelación
• Para congelar a menor temperatura se utilizan crioviales los cuales deben estar perfectamente sellados ya que cualquier líquido que se meta al vial compromete el proceso y la vida de la célula Se congelan células viables en medio enriquecido DMEM o RPMI
• Se adiciona dimetil sulfóxido (DMSO) como criopreservador
• Los criotubos se sumergen en alcohol isopropílico por una hora y se mete al congelador a -70°C
• De ahí se pasa al nitrógeno en donde pueden estar por meses de esta manera promovemos la formación de cristales pequeños.
• Este tren de congelación debe respetarse, de no ser así formarían cristales grandes dentro de la célula y la romperían

ROTAVIRUS

FAMILIA Reoviridae
VIRION Icosaédrico 70 nm de diámetro. No envuelto


CAPSIDE:
3 capas: externa (cápside externa): Vp4 Vp7
la intermedia (capside interna): Vp6
la interna (core)Vp1 Vp2 Vp3
COMPOSICIÓN RNA 15% Proteínas 85%
GENOMA: RNAds lineal (11 segmentos)



PROTEINAS: 8 VP (estructurales) y 5 NSP (no estructurales)


REPLICACIÓN: En citoplasma de los enterocitos del intestino delgado. Los viriones no pierden la cubierta de manera completa

TRANSMISIÓN: Vía fecal-oral infectando a las células epiteliales que recubren el intestino (enterocitos)

CARACTERISTICAS NOTABLES:

• Causa Gastroenteritis severas en niños y animales


• la partícula viral contiene ARN polimerasa y todas las enzimas necesarias para la producción de sus ARNm


• 6 grupos antigénicos (A a F).


• Los rotavirus del grupo A se clasifican en diferentes serotipos y genotipos

ESTABILIDAD:

• estables en un rango de pH de 3 a 9 Y por meses a 4°C, y aún a 20°


• mantiene su integridad y su infectividad tratado con solventes orgánicos éter, cloroformo, detergentes no iónicos (ausencia de lípidos)


• Inactivación con desinfectantes como detergentes iónicos (SDS), formalina, cloro, betapropiolactona y etanol al 95%, fenol debido a la pérdida de la capa externa.

1.- INGRESO AL ENTEROCITO: puede ingresar por endocitosis o por penetración directa.
Endocitosis, el VP 4,una vez activada, es la que va a reconocer a un receptor de membrana en los enterocitos. y por la tripsina pancreática da como resultado el VP5 y VP8 proporcionándole mayor infectividad y ocurriendo la endocitosis.
Penetración directa, el virus ingresa a través de la membrana con su cápside interna y el Core, el VP 7 se queda localizado en la membrana.

2.- FUSIÓN ENDOSOMA - LISOSOMA:
(Endocitosis) se forman los endosomas que se fusionan con los lisosomas estos vierten sus enzimas proteolíticas en los endosomas causando hidrólisis de la capa proteica (VP 6), dejando libre en el citoplasma al Core viral.

3.- REPLICACIÓN:

• Que se active la RNA polimerasa viral (VP 1) Esta va a producir RNAm, que van a realizar copias de cada uno de los 11 segmentos del RNA viral, que son los que van a contener los genes que van a codificar cada una de las moléculas estructurales y no estructurales



• En 8 horas está formada una estructura granular (VIROPLASMA) conformado por las proteínas sintetizadas y el RNA virales.



• La NSP 1 y la NSP 3 se van a acumular en el citoesqueleto y van a servir para el ensamblaje del PRECORE, a esta estructura se une la VP 2 en el viroplasma con intervención de la NSP 2 y la NSP 5 formándose el CORE
  


• También ocurre replicación del RNA y ensamblaje del VP 6 que va a conformar una cápside al cual se denomina partícula "Inmadura"
  


• Migran hacia el R.E.R. donde van a completar su maduración.



• Se sintetizan el VP 7 y la NSP 4 en el R.E.R. y son transportadas a donde se está completando la maduración del virus



• El VP 7 se constituirá posteriormente, conjuntamente con el VP 4, en la cápside externa del rotavirus completando de esta manera su maduración.

4.- LISIS CELULAR:

El ciclo de replicación termina cuando el virus es liberado al lumen intestinal por lisis celular. Al respecto se ha visto en estudios experimentales que la NSP 4 produciría cambios en la permeabilidad de la membrana del R.E.R. y eventualmente muerte celular Se ha podido observar que habría un incremento en la permeabilidad al calcio

VIRUS DE LA FIEBRE AMARILLA
Familia: Flaviviridae,
Género: Flavivirus amarilla
Transmitida: mosquito Aedes aegypti y otros mosquitos de los géneros Aedes
Estructura: virus icosaédrico y envueltos.
Material genético: ARN monocatenario de polaridad (+).
Tamaño: 40-50 nm.
Su envoltura: esta cubierta por:
Glucoproteínas M (de membrana).
Glucoproteínas E (de envoltura) que participa en la unión del virus a la célula.
Inactivación: mediante disolventes de lípidos (éter, cloroformo).Por calentamiento a 56 ºC durante 30 minutos Con luz ultravioleta



Replicación: en citoplasma de las células
Células: se pueden unir a fracción Fc de los macrófagos , monocitos
Penetración: por endocitosis (fucion de membrana y envoltura)
El genoma liberado: se une a ribosomas y sintetisa RNAm
2/3 partes traduce en poliproteinas que se subdividen por las proteasas en (NSP 1,2a, 2b ,3,4a ,4b ,5) de estas 6 tienen actividad de proteasas y una de polimerasa de RNAm que sintetiza un RNA de polaridad (-).
1/3 parte ARNm codifica para la cápside y envoltura (E1, E2,E3).



Codifica 3 proteínas estructurales (C=central, prM=matriz, E=envoltura) y 7 proteínas no estructurales

Virus Herpes Tipo II

Virus del Herpes Tipo II. Por : Rubio Juárez Uriel Joel.


Nombre: VHS: Virus del Herpes Simple ( tipo 1 ó 2).
El nombre de esta familia viral viene del griego "Herpein" (algo así como deslizarse, aludiendo a su capacidad de pasar de infección crónica a latente y de aquí a recurrente). La prueba científica del paso de infección aguda a crónica se obtuvo en 1950 por Burnet y Buddingh

Caracteristicas: Conta con un core o centro que contiene el ADN, una cápside icosaédrica; el tegumento y una membrana dispuesta como envoltura en las cuales se sumergen las glicoproteínas de la superficie.

Virión: 120 a 200 nm. En la envoltura se encuentran mas de 10 glucoproteínas distintas cuya función es la adsorción y la penetración en la célula hospedadora. Como la GP350/220 que se encarga de la adherencia y la GP 42 y 85 que medían la fusión, además que en la envoltura se induce la producción de anticuerpos neutralizantes. El Herpes del Tipo II, pertenece a los Alfavirus: Tiene un rango variable de posibles huéspedes, ciclo reproductivo relativamente corto, crecimiento fácil en cultivo, eficiente destrucción celular y alta capacidad para establecer latencia principalmente en ganglios sensoriales.

Consta de ADN bicatenario y líneal. Tamaño 125 y 240 KPB las cuales codificaran por lo menos para 100 proteínas distintas.

Son bastantes sensibles a la desecación, A pH bajo, el virus se inactiva con solventes lípidicos y detergentes.

Adsorcion y penetracion:
Replicacion:

La partícula virica contacta con receptores de la célula hospedadora.
Las GP de la capside contribuyen a que el virus penetre en el citoplasma por la fusión de la envoltura con la membrana citoplasmatica de la celula hospedadora, o bien por la formación de vacuolas fagociticas en cuyo interior se encuentra el virión. Desnudamiento: Se rompe la cápside y se libera un complejo de ADN vírico y proteínas que emigran hacia el núcleo, donde se va a producir la transcripción.

) Fijación a la superficie celular: Al igual que con muchos otros virus, el tropismo celular está determinado por la disponibilidad de los receptores adecuados en la superficie de la célula a ser infectada. El virus de fija a la membrana celular a un pH ambiente y por tanto cabe la posibilidad de la formación de sincitios entre las células infectadas y de transmisión de célula a célula aún en la presencia de anticuerpos humorales neutralizantes. Esto significa que la inmunidad mediada por células es importante en la supresión de infecciones por herpesvirus. ii) Entrada de la nucleocápside al citoplasma: La nucleocápside rodeada de tegumento es transportada a la membrana nuclear a la que se une. El genoma de ADN entra al núcleo. iii) Transcripción: Este es un proceso muy complejo, como es de esperarse por el gran tamaño del genoma. Hay tres clases de proteínas que necesitan sintetizarse para la producción de un virus maduro.
Alfa proteínas: Estas son las proteínas inmediatas tempranas. Involucradas en la regulación de la transcripción y que no se encuentran en el virión maduro. También implicadas en el control de la síntesis de beta proteínas.
Maduración de los virus herpes
  Etapas en la exocitosis del herpes virus desde el núcleo, en donde se ensambla el núcleo (core) viral, hacia la membrana plasmática. Ensamblaje y maduracion: Las capsides inmaduras del nucleo adquieren ADN y más proteínas que se unen a la superficie de la capside. Adquiere la envoltura de la membrana nuclear ( no de la citoplasmatica, como es habitual) Desde este momento, el virión es ya maduro e infectante. Las capsides inmaduras del nucleo adquieren ADN y más proteínas que se unen a la superficie de la capside. Adquiere la envoltura de la membrana nuclear ( no de la citoplasmatica, como es habitual) Desde este momento, el virión es ya maduro e infectante.

VHH-2 Virus del herpes humano tipo 2. Es el virus del herpes simple tipo 2, que produce herpes genital, el cual causa vesiculas y luego ulceras genitales.

El virus hace contacto con celulas de la piel por intermedio de receptores y ligandos específicos, tal como las células parabasales e intermedias genitales de la vagina y cervix

VIRUS ECHO

"Enteric Citopatogenic Human Orfhan"




Clasificación de Baltimore: Grupo IV- RNAss(+)

Familia: Picornaviridae
Género: Enterovirus (EV)
Especie: ECHO virus. Serotipos 1 - 9, 11 a 27, 29 a 34

Morfológicamente se asemejan a los otros picornavirus:

PROPIEDADES DE LOS PICORNAVIRUS
Virión esférico, diámetro 20-30nm
Sin envoltura
Simetría icosaédrica, 60 capsómeros
ARN ss (+)
Multiplicación citoplasmática
Cápside compuesta de pentámeros de prot´s VP1,VP2,VP3 y VP4

Receptor celular para ECHOvirus:
VLA-2: Familia de las integrinas. Serotipos:1-8
DAF: Decay Acelerating Factor. Serotipos:6,7,13,2129,22

CÉLULA BLANCO: Células del tejido linfoide: amígdalas, placas de Peyer

REPLICACIÓN:
El ciclo de replicación tiene lugar en el citoplasma de la célula.
El ARN viral infectante se traduce en una poliproteína que contiene proteínas de cubierta y proteínas esenciales para la replicación.

PROTEINAS FUNCIONALES:
 Proteinasa (desdoblan la poliproteina):
o Proteinasa de M o de maduración
o Proteinasa inicial 2A: efectúa los primeros cortes de la poliproteina
o Proteinasa 3C: ejecuta los otros cortes
 Polimerasa dependiente del ARN: para la síntesis de un nuevo RNA viral.
PROTEINAS ESTRUCTURALES:
 Proteínas de cápside
o Proteína precursora de la cubierta P1: Forma agregados de VP0, VP3 y VP1



Los efectos citopáticos progresan rápidamente de tal forma que las células afectadas se retraen y desarrollan un aumento en la refractividad; el citolpasma se hace granuloso, hay picnosis nuclear y finalmente lisis.

VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO

Género Papillomavirus
Familia Papovaviridae.
Virus pequeño de 55nm de diámetro
ADN de doble cadena
Desnudo, icosaédrica
formada por 72 capsómeras.
El ADN está constituida por casi 8000 bp.
Período de incubación es de 3 semanas a 8 meses, aunque puede prolongarse por años.

El genoma esta conformado por la zona temprana que esta conformada por:

• E1
• E2
• E4
• E5
• E6
• E7

Los genes E1 y E2 precoces intervienen en el control de la transcripción y replicación del genoma viral. La transcripción consiste en la producción de una molécula de RNA mensajero que contiene una copia de la información genética a partir del DNA. Aún se ignora cuál es la función del gene E4, mas se estima que fomenta la fase productiva del ciclo vital del virus papiloma. El gene E5 mejora la actividad del factor de crecimiento epidérmico. Los genes E6 y E7 obstaculizan el control de la transcripción y el ciclo celular de la célula huésped.

Los genes tardíos L1 y L2 codifican proteínas del cáspide viral usadas en la producción de los nuevos virus.L1 esla proteína q se une al receptor celular.

El aspecto más peligroso del virus papiloma humano es su potencial para causar cáncer. Dos genes, Rb y p53, regulan la división celular normal. El primero produce los factores de transcripción necesarios para el avance a través del ciclo celular. Esto denota que Rb impide que la célula se divida hasta que haya aislado suficientes proteínas para la división celular. E2F es la importante proteína que Rb produce, lo que convierte a Rb en un gene/proteína supresor de tumores. Esto impide que el ciclo celular prosiga hasta que se hayan acumulado suficientes proteínas, en especial la E2F. Cuando VPH infecta una célula, el gene E7 se fija a Rb de tal modo que Rb libera E2F y las otras proteínas. Esta es una señal para que el ciclo celular avance. En tanto E7 permanezca fijo a Rb, el ciclo celular continuará, causando así un ciclo de reproducción celular incontrolada, que es una de las características que definen a una célula maligna.

P53 es el otro gene que VPH ataca. En una célula, p53 actúa en respuesta al DNA dañado. Cuando se deteriora el DNA de una célula, p53 detiene la división celular y dirige a los genes comprendidos en la reparación de DNA a fin de corregir el daño. Si no es posible reparar el DNA, p53 causa entonces apoptosis (muerte celular programada), garantizando así que la célula dañada muera y no se reproduzca. La proteína E6 viral puede fijarse a p53 e inactivarlo. Lo anterior permite que el virus se apropie de la célula y se reproduzca a si mismo, dado que el gene p53 inhibido por el virus no puede detenerlo o comenzar el proceso de la muerte celular. La replicación repetida de células con información DNA incorrecta es el inicio de la formación de un tumor maligno.

VIRUS DEL EBOLA

CARACTERISTICAS

Familia de los Filoviridae (filovirus)
RNA ss (-)
Helicoidal
Envuelto
Fiebre hemorrágica viral
Enfermedad infecciosa
Altamente contagiosa
Período de incubación varía de 2 a 21 días
Año 1976 murieron alrededor del 85% de los infectados
Murciélago de fruta
No hay tratamiento
No existe vacuna

CELULA BLANCO
Macrófagos

REPLICACION




ATTE. Reyes Garces Jose Angel

PARVOVIRUS B19

FAMILIA: Parvoviridae
COMPOSICION: DNA (20%), proteinas (80%)
GENOMA: DNA de cadena sencilla lineal, 5kb, Pm 1.5 a 2.0 millones
VIRION: Icosaedrico, 18 a 26nm de diametro, 32 capsomeros
PROTEINAS:una pricipal y una menor
ENVOLTURA: ninguna
REPLICACION: en el nucleo, depende de las funciones de las celulas del huesped
CARACTERISTICAS NOTABLES: viruas sencillo
El patogeno de humanos B19 presenta tropismo par eritrocitos

REPLICACION DEÑL PARVOVIRUS.
1.- union al antigeno P del eritrocito
grupo sanguineo (globosido), este se expresa sobre los eritrocitos maduros, precursores
eritrides, megacariocitos, celulas endoteliales, palcenta e higado y corazones fetales
2.- traslocacion del DNA viral al nucleo
3.- transcripcion del RNA no estructural y
4.- RNA de las proteinas tradias de la capside, seguido por
5.- traduccion de las proteinas. No separables en el tiempo
6.- autoemsamblaje de la capside
7.- accion de la proteina no estructural sobre el DNA viral
8.- traslocacion de la capside al nucleo
9.- replicacion de DNA
es necesario que la celula huesped entre en Fase S (segunda fase del ciclo biologico, donde
se lleva a cabo la sintesis de DNA), pero el parvovirus no tiene la capacidad para inducir
las celulas en reposo para iniciar la sintesis de DNA, por lo que necesita de varias
DNApolimerasas. Las secuencias terminales sobre el DNA lineal del parvovirus se emplaen
como cebadores para comenzar la sintesis de DNA
10.- introduccion del DNA en capsides intactas
11.- liberacion del virus por lisis celular

Sarampión

VIRUS DEL SARAMPIÓN
Características generales del virus

Género
Morbillivirus,
Familia
Paramyxoviridae
Forma
Esférico, pleomórfico, 150nm o más de diámetro
Genoma
De RNA de una sola hebra en sentido negativo
Replicación
Citoplasma
Proteínas
6 proteínas estructurales
Receptores
CD46, CD150

Proteínas y su función

H:Unión a la célula (hemaglutinina)


F:Responsable de la fusión de la envoltura del virus a la membrana plasmática en la fase inicial de la infección y de la fusión de las membranas celulares (formación de sincicios), lo que permite el paso del virus de una membrana a otra.


N:Asociación y protección al genoma viral. El 97% ken peso de la nucleocápside (N: ARN) corresponde a la proteína N.


P:Participa en la replicación y transcripción del genoma viral


L:Presenta actividad de polimerasa.


M:Proteína de matriz


C,V:La cistrónica del gen P codifica para estas dos regiones no estructurales.

VIRUS LASSA

Miembro de la familia Arenaviridae

AR ARN monocatenario negativo (virus (-)ssRNA)

Los Los huéspedes naturales del virus de Lassa son roedores del género Mastomys. La transmisión

del del virus desde su reservorio a los humanos causa fiebre de Lassa, una enfermedad febril aguda asociada con el sangrado.

El El genoma del virus de Lassa, como la de otros arenavirus, consta de dos segmentos de una sola cadena de ARN.

El El segmento pequeño (S) es de 3,4 kb de longitud, y el segmento (L) es de 7 kb de longitud.

El ARN S codifica el segmento nucleoproteina NP y la glicoproteína precursora preGP-C

El ARN L (L-ARN) codifica el segmento de ARN dependiente de la RNA polimerasa L y la proteína Z, que une el zinc y actúa como una proteína de la matriz.

1. Virus de Lassa entra en la célula a través de la molécula del receptor alfa-distroglicano y entrar a las células a través de endosomas.

2. La envoltura se fusiona con la membrana de la vesícula endosomica para suministrar así la nucleocapside al citoplasma. El virión debe de contener una polimerasa viral, para producir el ARN mensajero y una plantilla completa de ARN (+)

3. Se traducen las proteínas a partir de los ARNm, incluyendo una glucoproteína G que es glucosilada en el retículo endoplásmico, procesada luego en el aparato de Golgi, y suministrada finalmente a la membrana celular.

4. El genoma se replica a partir de la plantilla de ARN(+), y las proteínas N,L y NS se asocian con el genoma para formar la nucleocápside.

5. La proteína matricial se asocia a la membrana, tras lo cual ocurre el ensamblaje de la nucleocapside

6. El virus sale por gemación a partir de la célula (como virión en forma de proyectil).

ADENOVIRUS

CICLO REPLICATIVO
Se distinguen las siguientes etapas:
1. Unión a la célula. Es lento, y toma varias
horas. Implica la interacción de la glicoproteína
denominada fibra con receptores
celulares (moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad clase I y receptores
coxsackie-adenovirus).
2. Internalización. Implica la interacción del
pentón con las integrinas V3 y V5 . La
internalización es regulada por segundos mensajeros
celulares, que favorecen la progresión
del ciclo celular, y la reorganización del
citoesqueleto de actina, el cual a su vez jugaría
un rol importante en la penetración del
virus (endocitosis mediada por clatrina).
3. Penetración. Se da por endocitosis en vesículas
revestidas por clatrina. La membrana
de la vesícula fagocítica se rompe por acción
tóxica del pentón. Se produce entonces
la liberación de la partícula viral dentro del
citoplasma, con pérdida de proteínas de la
cápside y denudamiento del DNA viral .
4. Migración. El core migra desde el citoplasma
al núcleo via microtúbulos y el DNA viral
entra al núcleo a través de los poros nucleares.
Una vez en el núcleo el DNA viral es
convertido en un complejo histonas celulares-
DNA viral, y pueden iniciar la replicación.
5. Replicación. La replicación del DNA ocurre
en el núcleo, la proteína viral (TP) actúa como
primer o cebador (Figura 3). Dos proteínas
más codificadas por el virus participan en la
replicación: Ad DBP y Ad DNA pol. Además
tenemos proteínas celulares en el núcleo
que participan en la replicación del genoma
viral. Se producen además durante la
replicación viral las siguientes proteínas:
• Proteínas tempranas inmediatas: E1A.
• Proteínas tempranas: E1B, E2A, E2B, E3,
E4.
• Proteínas tardías: proteínas virales.
6. Ensamblaje del virión. Previo al ensamblaje
se sintetizan las proteínas estructurales, las
cuales son sintetizadas a partir de los genes
virales tardíos (transcritos sólo del ADN viral
replicado), siendo los genes virales tempranos
responsables de la síntesis de productos que
modifican el metabolismo celular y de factores
de virulencia . El ensamblaje ocurre
en el núcleo, pero empieza en el citoplasma,
donde polipéptidos individuales se ensamblan
en capsómeros (hexones y pentones). Las
cápsides inmaduras y vacías son ensambladas
en el núcleo celular, donde el core es
formado por el ADN genómico y proteínas
core asociadas. Las partículas virales tienden
a asociarse en el núcleo.

El adenovirus fue descrito por primera vez
como agente viral único en 1953 por Rowe et
al., mientras intentaban establecer cultivos celulares
de amígdalas y tejido adenoideo. Rowe
reconoció que un agente transmisible estaba destruyendo
a las células epiteliales.
Actualmente se reconoce que los adenovirus
causa con más frecuencia enfermedades del
tracto respiratorio, sin embargo dependiendo del
serotipo infectante, puede causar otras enfermedades
como gastroenteritis, conjuntivitis,
cistitis, hepatitis y exantema . El espectro
clínico de la enfermedad del tracto respiratorio
va desde un cuadro de rinofaringitis
hasta un cuadro de neumonía fulminante. Para
algunos serotipos, el cuadro clínico varía dependiendo
del lugar de la infección, así tenemos
que el serotipo 7 adquirido por inhalación
esta asociado con enfermedad severa del tracto
respiratorio inferior, mientras que la transmisión
oral del mismo serotipo causa infección
asintomática o enfermedad leve.
Los adenovirus son endémicos en la población
pediátrica, se menciona que son responsables
de hasta el 10% de las infecciones del tracto
respiratorio, y que causan el 10% de casos de
gastroenteritis aguda .
En la actualidad se utiliza las propiedades de
los adenovirus para transmitir material genético
en la terapia de enfermedades como la fibrosis
quística y el cáncer de pulmón. Para este fin se
utiliza al adenovirus como vector para determinados
transgenes

ESTRUCTURA DEL ADENOVIRUS
El adenovirus es un virus ADN de 60-90 nm
de diámetro. Se caracteriza por no poseer cubierta
externa. El virión tiene forma icosaédrica
y se compone de:
- Una cápside proteica constituída por 252
capsómeros, que representa el 87% del peso.
- Un núcleo que contiene el genoma de ADN
viral y 4 proteínas internas.
De los 252 capsómeros, 240 son hexones y
12 son pentones. Los hexones se disponen conformando
los lados de la superficie icosaédrica y
los pentones conforman los vértices

Virus Epstein Baar

Virus de la mononucleosis infecciosa, tambien llamada enfermedad del beso. la infeccion se da por contacto con secresiones orales.
Familia: Herpesviridae
Material genetico: DNAds, contenido en nucleocápside rodeado por una envoltura viral.
Célula diana: linfocitos B y celulas epiteliales orofaringe
La glicoproteina de su envoltura gp350(proteina de adherencia virica), se une al receptor viral, la molécula CD21(receptor del componente C3D del complemento)

Tiene 2 sistemas independientes para replicarse:

1. Durante la produccion activa del virus o infeccion lítica.
2. durante la etapa de latencia de la infeccion, para permitir que el genoma viral circular sea duplicado durante cada ciclo de division celular.

La infeccion ocurre por la fijacion de la particula vírica a los receptores celulares especificos y, la envoltura del virus, se libera la nucleocapside dentro de la celula. La nucleocapside se transporta al núcleo, donde el DNA es descapsidado.

Genera 3 diferentes RNAm.
1.- RNAm temprano o alfa = codifica 5 proteinas reguladoras.
2.- RNAm temprano retardado o beta = codifica proteinas relacionadas co la replicacion del DNA incluyendo DNApol.
3.- RNAm tardio o gamma = codifica proteinas estructurales del virus.

Durante la primer etapa (temprana inmediata) , un RNApol celular transcribe 1/3 genoma vírico. El RNAm temprano codifica ciertas proteinas reguladoras que estimulan la sintesis de proteinas tempranas retardadas.

En la segunda fase, solo tiene lugar despues de que van formando las proteinas tempranas, en esta se transcribe aproximadamente el 40% del genoma vírico.

La sintesis de DNA se lleva a cabo en núcleo, tras la infeccion el genoma parece circularse y la replicacion tiene lugar por el mecanismo de circulo rodante, durante la division celular.
la nucleocapside virica se ensambla en el nucleo y el virus adquiere su envoltura a traves de la membrana nuclear.

Los viriones se liberan de la celula del tericulo endoplasmico mediante exocitosis.

Virus de la viruela.

Viirus complejo, y envuento de DNAds.
Bajo el microscopio electrónico se puede ver como una partícula en forma de bloque o elipsoidal que mide cerca de 230x400nm. El núcleo contiene el genoma viral de gran tamaño, DNA lineal de doble cadena; las cadenas de DNA están conectadas por los extremos mediante asas terminales en horquilla.
El cirion contiene multiplicidad de enzimas, incluso un sitema de transcripción que puede sintetizar, poliadenilar, cubrir y metilar al RNAm viral.
Se compone de proteínas (90%), lípidos (5%) y DNA (3%).

Multiplicación.
Los poxvirus son únicos entre los virus DNA, por que su ciclo completo de multiplicación ocurre en el citoplasma de las células infectadas. La perdida de la cubierta requiere una proteína recien sintetizada codificada por el virus.

Fijación, penetración y desnudamiento.
Entran en la célula mediante vacuolas fagocíticas producidaspor esta última.
La primera etapa de descubrimiento o perdida de la cubierta, ocurre por medio de enzimas hidrolíticas de la vacuola, esto liubera al núcleo viral hacia el interior del citoplasma. Entre las diversas enzimas que hay dentro de las partículas de poxvirus se encuentra una polimerasa del RNA viral que transcribe cerca de la mitad del genoma viral en RNAm temprano. Estas partículas de RNAm se transcriben dentro del núcleo del virus y a continuación se libera hacia el citoplasma. La etapa de descubrimiento de segunda fase libera al DNA viral de los núcleos; esto requiere síntesis tanto de RNA como proteínas. En esta etapa se inhibe la síntesis de macromoléculas de la célula huésped.

Replicación de DNA viral y síntesis de proteínas virales.
Entre las primeras proteínas elaboradas estan las enzimas que participan en la replicación del DNA, entre ellas, la polimerasa del DNA y cinasa de la timidina.
La replicación del DNA viral se inicia poco después de la descarga del mismo durante la segunda fase de descubrimiento, esto ocurre de 2 a 6 horas después de la infección en zonas definidas del citoplasma, que se manifiestan como "fabricas" o cuerpos de inclusión en las micrografías electrónicas.
El patrón de la expresión génica viral cambia notablemente al iniciarse replicación del DNA viral. Se inhibe la síntesis de muchas de las proteínas tempranas. El RNAm viral tardío se traduce en grandes cantidades de proteínas estructurales y contidades pequñas de otras proteínas y enzimas virales. A continuación se interrumpe la replicación del DNA.

Maduración.
Muchos de los polipéptidos que se convierten en partes de la partícula viral se modifican por añadidura de azúcares (glicosilación) o fósforo (fosforilación) o por segmanetación proteolítica.

Suliberación ocurre por gemación de donde obtienen una cubierta de la menbrana celular.

Por: Sánchez Avila Luz Amalia

CITOMEGALOVIRUS

CITOMEGALOVIRUS (HCMV)

Nombre oficial	Herpes virus humano 5
Familia	Herpesviridae
Subfamilia	Betaherpesvirinae
Material Genético	DNA doble cadena
Estructura	Cápside Tegumento amorfo o matriz Envuelta rica en fosfolípidos
Características Biológicas	•Lento crecimiento •Produce en la célula efecto citomegálico •Permanece latente en glándulas secretoras, células linfoides, riñón y otros tejidos •Se replica in vitro solo en fibroblastos humanos
Epidemiología	•Distribución: Mundial •Transmisión: Por contacto directo con fluidos biológicos y secreciones corporales. •Principales vías de transmisión: Oral, respiratoria, sexual, parenteral, transplante de órganos y transplacentaria.
Manifestaciones clínicas	Hepatoesplenomegalia, ictericia, exantema petequial, microcefalia, afectación del oido interno, alteraciones motoras, coriorretinitis y microcalcificaciones cerebrales.

El CMV forma parte del complejo TORCH, apelativo que reúne a varias entidades (Toxoplasma gondii, Rubéola, Citomegalovirus, y Herpes virus)

REPLICACIÓN

La replicación viral ocurre en le núcleo de la célula húesped y lleva consigo la expresión de varios tipos de proteínas: inmediato-tempranas, tempranas y tardías.

1. las proteínas específicas en la envoltura viral se unen a receptores de la célula húesped en la membrana celular.

2.La penetración se logra cuando se fusiona la envoltura iral con la membrana celular, liberando la nucleocápside directamente en el citoplasma.

3.El virion sin recubrimiento y el ADN vírico penetran en el núcleo.

4. En el núcleo, el ADN viral se transcribe a ARNm temprano que son transportados al citoplasma para la traducción de proteínas tempranas. Estas proteínas tempranas vuelven a introducirse en el núcleo y participan en la replicación del ADN del virus. El ADN viral se transcribe a continuación, en el ARNm final que sale al citoplasma para su traducción en la proteínas tardías (nucleocápside y envoltura).Las proteínas de la cápside y el material genético del virus se ensambla.

5. Posteriormente la cápside adquiere una envoltura primaria al ponerse en contacto con la hoja interna de la envoltura nuclear, misma que pierde al fusionarse con la hoja externa de dicha envoltura. Una vez en el citoplasma continua la maduración al rodearse con el tegumento.

6. Finalmente la envoltura rodea a las dos capas anteriores que adquiere cuando el virión penetra a aparato de Golgi. Las partículas maduras son trasnportadas a la superficie de la célula a través de dicho organelo. La progenie del virus se libera de la célula a través de canales citoplasmáticos.