Western blot

Western blot

Es un metodo en biología utilizado para la detección de proteínas en una muestra de un tejido homogeneizado o extracto. Las proteínas son transferidas desde el gel hacia la membrana, donde son examinadas utilizando anticuerpos específicos para la proteína. El verbo blot en inglés significa manchar con tinta y el nombre Western (oeste, occidental) le fue dado por el investigador W. Neal Burnette (Analytical Biochemistry, 112:195-203, 1981) como un juego de palabras por los nombres Southern y Northern de las técnicas que se usan con el mismo fin pero se aplican a los ácidos nucleicos. Todo empezó cuando Edwin Southern. diseñó la técnica, que lleva su nombre, para detectar ADN, luego por oposición al punto cardinal Sur, se llamó Northen aplicada al ARN . Finalmente como una especie de broma la técnica de inmunoblotting (inmunotransferencia) para proteínas terminó siendo denominada Western.

A partir de virus purificado y tratado adecuadamente se puede correr un gel de proteínas (PAGE) en el que aparecerán las bandas correspondientes a las proteínas del virus .Recordemos que las proteínas primeramente se desnaturalizan con SDS y luego migran, por efecto de la aplicación de una corriente eléctrica, según su peso molecular.

Con EL SDS Las proteínas a analizar son hervidas a 100 ºC en presencia de un exceso de SDS y 2-mercaptoetanol. En esas condiciones el tiol rompe los puentes disulfuro que pudieran existir y el agente desnaturalizante hace que la proteína se desdoble en sus polipéptidos constitutivos, A causa de ello la carga intrínseca del péptido se hace insignificante ante el exceso de carga negativa del SDS; como consecuencia, la carga de todas las moléculas será prácticamente idéntica. Por lo que su desplazamiento en un campo eléctrico, en un gel de determinada porosidad, dependerá exclusivamente de su tamaño molecular.

Cuando termina la corrida se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y conservan la posición original que tenían en el gel. ¡De acuerdo a su peso molecular!

Luego la membrana se incuba (se pone en contacto), por ejemplo sumergiéndola, con una solución diluída del suero de una persona que se sospecha que pueda estar infectada. Luego de un tiempo, los anticuerpos contra las proteínas del virus van a reaccionar produciéndose la unión antígeno-anticuerpo

. Por ejemplo: si hay anticuerpos contra p24 en la banda donde se ubicó el antígeno o polipéptido p24 ahora también están los anticuerpos. Se hace luego un lavado de la tira, si los anticuerpos no están pegados se van con el lavado, los pegados quedan.

mas del acido nitroso

En soluciones acuosas, el ácido nitroso (HNO2) desamina oxidativamente las aminas primarias aromáticas, de tal forma que convierte la citosina en uracilo Y adenina en la molécula parecida a la guanina, la hipoxantina (que forma dos de los tres enlaces de la guanina con la citosina)

Efecto de la hipoxantina como mutágeno
De tal forma que el tratamiento del ADN con el HNO2 o compuestos como las nitrosaminas que reaccionan para formar ácido nítrico, resulta en ambas transiciones A•T – G•C y G•C – A•T

AGLUTINACION

Cuando la acción del anticuerpo está dirigida a antígenos que están en la superficie o forman parte de la membrana de un microorganismo o de una célula, el anticuerpo produce una agregación, dando lugar a un fenómeno visible llamado aglutinación. Esta reacción se hace visible por las partículas de latex. Las células recubiertas con partículas de virus pueden ser aglutinadas por anticuerpos contra estos virus. Igualmente pueden emplearse para detectar virus que estén en células infectadas, ya que los anticuerpos contra estos virus producirán la aglutinación de las células, debido a la expresión de antígenos víricos en sus membranas.

La aglutinación se lleva a cabo en solución ≥ 0.15 M de NaCl. Aunque la superficie de las partículas posea anticuerpos, es posible que la aglutinación no se produzca en caso de que la concentración salina sea excesivamente baja.

El las reacciones de aglutinación sólo interaccionan antígenos superficiales y no los citoplasmáticos, dado a que es imposible que los Ac penetren en el interior de las células.

Placas líticas

Método de Plaqueo

Este método consiste en infectar un cultivo celular y agregar el medio nutritivo del mismo en fase semisólida (agar, agarosa, carboximetilcelulosa, metilcelulosa). De esta manera, cuando un virus infecta una célula, su progenie sólo puede migrar a las células inmediatamente vecinas, y no a las alejadas, ya que el medio semisólido limita su movilidad. Coloreando las células se observarán zonas no teñidas (placas de lisis), correspondientes a las células destruídas por la partícula infecciosa inoculada y las nuevas partículas que ella produjo (Fig.4). si la coloración se realiza con un colorante vital (rojo neutro), que no mata las células teñidas ni al virus, es posible tomar material de una placa, que contendrá la progenie viral correspondiente a un único virus infectante, constituyendo, por lo tanto, un “clon”.

El título de la preparación viral se calcula contando el número de placas que produce una determinada dilución de la muestra, y haciendo las correcciones necesarias para llegar a la cantidad de virus en la muestra original. Cada partícula infecciosa da origen a una placa de lisis, y se denomina en este caso "Unidad Formadora de Placa" (UFP). El título se expresa como "UFP/ml" o "UFP/g", según corresponda.

Por ejemplo: Supongamos que la inoculación de 0,2 ml de una dilución 1:1000 de una suspensión viral produce 84 placas de lisis en un cultivo celular. Esto es equivalente a decir que en ese volumen de esa dilución hay 84 UFP. Debemos expresar el título en "UFP/ml".

0,2 ml = 84 UFP

1 ml = (84 UFP x 1 ml): 0,2 ml= 420 UFP

Son 420 UFP/ml en la muestra diluída 1:1000, por lo tanto la muestra original tiene

420 x 1000 UFP/ml.

En notación científica:

4,2 x 10⁵ UFP/ml.

Alejandra Sánchez Barrera