REPLIACIÓN VIRAL

La siguiente semana terminamos las exposiciones de la inactivación y técnicas de estudio de los virus.
El día viernes es el primer examen parcial.
Empezamos a preparar el tema de replicación viral.
* Pasos de la replicación viral.
* Contenido de cada uno de los pasos.
* Fase de eclipse de acuerdo a la clasificación de Baltimore.
Seguiremos trabajando en equipos (estos se formaran en el aula, no son los mismos de los trabajos pasados).
Suerte para todos.
Guadalupe Avilés.

ESTABILIZACION CON SALES

La estabilizacion con sales es un metodo de inactivacion de los virus utilizado comunmente en la produccion de vacunas.
Muchos virus pueden ser estabilizados por concentraciones del 1 mol/L de sales; el mecanismo por el cual las sales estabilizan a las preparaciones.
Las sales más utilizadas para este tipo de inactivacion son el cloruro de magnesio y las ales de aluminio.

fotos virus de Newcastle

Enfermedad de Newcastle

EPIDEMIOLOGÍA

Huéspedes

· Muchas especies de aves tanto domésticas como salvajes
· Los índices de mortalidad y de morbilidad varían según las especies y en función de la cepa viral
· Las gallinas son las aves de corral más susceptibles, los patos y los gansos son las menos susceptibles
· Puede existir un estado portador en las psitacinas y en algunas otras aves salvajes

Transmisión

· Contacto directo con las secreciones de las aves infectadas, especialmente las heces
· Comida , agua, instrumentos, locales, vestimentas humanas, etc., contaminados

Fuentes de virus

· Secreciones respiratorias, heces
· Todas las partes de las aves muertas
· El virus es transmitido durante el período de incubación y por un período limitado durante la convalecencia.
· Se ha demostrado que algunos psitácidos transmiten durante más de un año el virus de la enfermedad de Newcastle de manera intermitente

DIAGNÓSTICO

El período de incubación de 4-6 días

Diagnóstico clínico

· Síntomas respiratorios y/o nerviosos: jadeo y tos, alas caídas, arrastran las patas, cabeza y cuellos torcidos, desplazamientos en círculos, depresión, inapetencia, parálisis completa.
· Interrupción parcial o completa de la producción de huevos.
· Huevos deformados, de cáscara rugosa y fina y que contienen albúmina acuosa
· Diarrea verde acuosa
· Tejidos hinchados en torno a los ojos y el cuello
· La morbilidad y mortalidad dependen de la virulencia de la cepa del virus, del grado de inmunidad a la vacunación, de las condiciones ambientales y del estado de las aves de la explotación.

Lesiones

· La enfermedad de Newcastle no produce lesiones patognómicas macroscópicas
· Varias aves deben ser examinadas para realizar un diagnóstico tentativo.
· Para el diagnóstico final se debe esperar el aislamiento del virus y su identificación
· Las lesiones que se pueden encontrar son: edema del tejido intersticial o peritraqueal del cuello, especialmente cerca de la entrada torácica, congestión y algunas veces hemorragias en la mucosa traqueal, petequia y pequeñas equimosis en la mucosa del proventrículo, concentradas alrededor de los orificios de las glándulas mucosas, edema, hemorragias, necrosis o ulceraciones del tejido linfoide en la mucosa de la pared intestinal o edema, hemorragias o degeneración de los ovarios

Diagnóstico diferencial

· Cólera aviar
· Influenza aviar
· Laringotraqueítis
· Viruela aviar (forma diftérica)
· Psitacosis (clamidiosis) (Aves psitácidas )
· Micoplasmosis
· Bronquitis infecciosa
· Enfermedad de Pacheco del papagayo (Aves psitácidas)
· También errores de manejo, tales como falta de agua, aire, alimentación

VIRUS COMPLEJOS

Con ligeras variantes, presentan lo siguiente: Una cabeza icosaédrica que alberga el ácido nucleico, una cola de estructura helicoidal en forma de cilindro hueco, un collar de capsómeros entre la cabeza y la cola. Una placa basal, al final de la cola, con unos puntos de anclaje que sirven para fijar el virus a la membrana celular. De la placa salen también unas fibras proteicas que ayudan a la fijación del virus sobre la célula anfitriona. Como ejemplo de este tipo de virus se encuentran la mayor parte de los virus bacteriófagos (que infectan las bacterias).

DETERGENTES

Para que una sustancia sea considerada un detergente debe actuar de manera efectiva en la eliminación de las grasas y la suciedad de los tejidos, sin afectar apreciablemente el tejido mismo.

La mayoría de los detergentes son compuestos de sodio del sulfonato de benceno sustituido, denominados sulfonatos de alquilbenceno lineales (LAS). Otros son compuestos de alquilbencen sulfatos de cadena ramificada (ABS), que se degradan más lentamente que los LAS.

En el area de virologia medica son importantes ya que teines Enzimas, las que son capaces de hidrolozar las proteínas de la envoltura y de la capside permitiendo que se exponga el material genetico ya sea para ser inactivado o estudiado.

Algunos de los mas usados en el area de virologia para tratamiento de virus para exponer su material genetico para algunos estudios son los siguientes: Nonidel p40 y triton x100

Radio Inmuno Análisis (RIA)

Fue descrita por primera vez por Yalow/Bason. Con concentraciones conocidas de anticuerpo marcado radiactivamente y antígeno frío (Sin marcar). Es un ensayo de competición.

La técnica se basa en medir la cantidad de antígeno marcado que se desplaza de los lugares de unión del anticuerpo debido a la llegada y posterior competición del antígeno frío (Que es la muestra problema), conociendo así la cantidad de antígeno frío que teníamos en nuestra muestra. La medición se realiza de la fracción libre que queda, antes y después de la adición del antígeno frío.

Es una técnica inmunológica en la que se utilizan radioisótopos para detectar antígenos o anticuerpos en líquidos biológicos.

En este ensayo se incorpora una reacción de enlace competitivo, en la que una cantidad fija de antígeno marcado radiactivamente y antígeno de la muestra compiten por un número limitado de sitios de enlaces específicos con el anticuerpo. La unión de los dos antígenos con el anticuerpo forma un complejo precipitable. El porcentaje de antígeno marcado que se precipitadisminuye a medida que la concentración de antígeno no marcado en la muestra aumenta. Por tanto, la concentración de antígeno en la muestra problema es inversamente proporcional a la cantidad de radioactividad de la fracción enlazada.

Sea antígeno (Ag) la sustancia que quiere medirse, Ag* la misma sustancia que contiene en su molécula un isótopo radioactivo y el anticuerpo (Ac) que reacciona específicamente con los anteriores y que se encuentra en una cantidad insuficiente para unir todas las moléculas de antígeno presente. Si se incuba una muestra que contenga Ag, Ag* y Ac, los dos Ag y Ag* compiten por su unión con Ac.

Tras producirse la reacción, se separan los antígenos unidos (Ag-Ac, Ag*-Ac) de los libres Ag*, Ac). Una vez separados se mide la radioactividad de las fracciones unida y libre. Utilizando curvas de calibración obtenidas con patrones de los que se conoce la concentración de Ag, es posible mediante la relación entre el Ag libre y unido calcular la concentración de Ag en la muestra problema.

Los métodos de separación del Ag libre y unido pueden agruparse en tres tipos:

• Método de adsorción
  El Ag libre se retiene superficialmente en un material insoluble adecuado (carbón activo, silicato magnésico, resinas de intercambio iónico). La centrifugación deja en el sobrenadante la fracción unida y lleva al sedimento la fracción libre.
• Método de precipitación
  El Ag unido se separa del libre precipitando el Ag unido con compuestos precipitante de proteínas como el sulfato amónico, etanol, ácido perclórico. Tras centrifugar, el Ag unido queda en el sedimento y el libre en el sobrenadante.
• Método de doble anticuerpo
  El Ag unido puede precipitarse con un segundo Ac para él. Después de centrifugar, el Ag unido queda en el sedimento y el libre en el sobrenadante.

Dado que utiliza radioactividad es muy sensible. La mas sensible de todas estas técnicas, pudiendo llegar a detectar cantidades del orden de picogramos.

TRATAMIENTOS MECÁNICOS

Maceración

Proceso de extracción sólido-líquido ejerciendo sobre los tejidos movimientos de rotación.

• Mortero
• Homogenizador

Centrifugación

Se aplica la fuerza centrifuga. Los tejidos infectados con virus se centrifugan para sedimentar los restos de los tejidos.

Ultracentrifugación

Para sedimentar partículas víricas es necesario la ultracentrifugación.

• Aislamiento y concentración del virus
• Además se puede aislar y concentrar partículas citoplasmáticas, enzimas y proteínas.

Cambios bruscos en la presión osmótica.

Produce cambios en las proteínas de la capside

Como ejemplo tenes la transferencia de KCl 4M a agua.

Vibración sónica

(10000 a 20000 kilociclos)

Destruye la mayoria de virus con forma cilindrica.

Ineficaz con virus icosaédricos.

Deshace agrupaciones de virus.

Desecación

La resisten fagos pequeños con RNA

ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay)

La técnica ELISA (Análisis Inmuno Absorbente Ligado a Enzimas) Se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, puede ser medido espectrofotométricamente.


Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes :

Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc.. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.
Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.


Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.

Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. En el esquema se muestra la reacción asociada a un ELISA directo.

TIPOS DE ELISA

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).

ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señál debida a la unión de dos o más anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.

ELISA 'sandwich'. (ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

Efecto del pH en virus.
En general los virus prefieren el PH fisiológico (neutro) por q así se mantienen estables.
Los cambios de pH además de afectar a la envoltura de las proteínas también afectan a la carga eléctrica de los grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos. Esta alteración de la carga superficial de las proteínas elimina las interacciones electrostáticas que estabilizan la estructura.
v Técnica utilizada.
Lo que se realiza es un buffer con diferentes pH ya sea alcalino o básico, para que se pueda alterar las proteínas del virus.

Definición de virus

Definición de virus
Es una entidad patógena, que carece de procesos metabólicos; la cual está formada por proteínas y ácidos nucleicos (DNA o RNA);esta entidad tiene la capacidad de replicación para lo cual necesita de una célula hospedera; el tamaño y forma de los virus son muy variables, pueden ser icosaédricas, helicoidales y complejas

Exposicion H2O2 y Acido Nitroso HNO2

EL PERÓXIDO DE HIDRÓGENO Concentraciones (3 a 9%)

Desinfectante

El peróxido de hidrógeno es un antiséptico general.

Su mecanismo de acción se debe a sus efectos oxidantes: produce OH y radicales libres que atacan una amplia variedad de compuestos orgánicos (entre ellos, lípidos y proteínas que componen las membranas celulares de los microorganismos).

La enzima catalasa presente en los tejidos degrada rápidamente el peróxido de hidrógeno, produciendo oxígeno, que dificulta la germinación de esporas anaerobias.

APLICACIÓN EN VIROLOGÍA: la actividad de la peroxidada se pone en evidencia con sustratos como la bencidina α- naftol y otros.
En presencia de H2O2 recibe electrones donado por la oxidación de la diaminobenzidina que forma un precipitado café visible .
La aplicación ideal para este procedimiento rápido de laboratorio es de detección directa del anfígeno viral en el material clínico del paciente.




ACIDO NITROSO

El ácido nitroso se usa en la diazotación del benceno, para luego unirse a un naftol y producir diferentes colorantes, muy utilizados en la industria.

El ácido nitroso se emplea para convertir aminas en diazos.
Mecanismo de acción: Se trata de un agente mutágeno que provoca la desaminación oxidativa de la adenina y la citosina, originando transiciones.

virus complejo

VIRUS HELICOIDALES

La capside de los helicoidales se componen de un solo tipo de subunidad capsomeros, que se colocan alrededor de un eje central para formar una estructura helicoidal que pueda tener una cavidad central, o el tubo del hueco. Este arreglo da lugar a virions barra-formados o filamentosos; pueden ser altamente rígidos(los desnudos) o muy flexible(envueltos). El material genético, es RNA generalmente, y en algunos casos solo-trenzado, pero ssDNA; el material genetico esta pegado a la capside por diferencias de cargas; la longitud de la capside helicoidal se relaciona con la longitud del ácido nucleic contenido dentro de ella y el diámetro es dependiente en el tamaño.

ACCION DEL FORMALDEHIDO EN LOS VIRUS

El efecto general del formaldehido, es hacer una estructura de las proteinas más firme, mas densa y menos permeable, que constituye la base de la accion atringente. Mediante la saturación gradual de grupos muy cargados y reactivos, las proteínas se hacen menos solubles y químicamente mas inerte.

los grupos amino e imino son los más reactivos, pero, además de ellos, reaccionan mas o menos fácilmente con grupos tales como los solfhidrilos e hidroxilo y los de enlce peptidicos y estructuras anulares.

La penetración del formaldhido puede concebirse en 2 formas:
a)como un difusion del formaldehido a traves de la proteína hidratada, lo qaue es posible desde el punto de vista estereoquímico, dado el poco tamaño de la molécula, de formaldehido.
b)puede producirse escalonadamente de una reacción reversible a otra, y talvez con los grupos amino sirviendo de escalones por los agentes quimicos pasa de la superficie al interior.

A medida que se producen las reacciones en la pro teina, ambas vias quedan bloqueadas gradualmente. Asi cabe esperar, pues que la inactivación del ácido nucleico continue a ritmo cada vez mas lento.

virus icosaedricos

Virus Icosaedricos

Los virus icosaedricos o casi-esfericos estan formados por 20 caras triangulares, 30 aristas y 12 vertices; dando origen a un icosaedro regular y dejando un hueco central donde se situa el acido nucleico.

Los capsomeros tienen forma de anillo. Los apices de los capsomeros estan rodeados por otros cinco capsomeros y reciben el nombre de pentones. Las caras triangulares de estos tambien se componen de seis capsomeros y reciben el nonbre de hexones.

Estos se asocian a traves de la union de enlaces covalentes para encerrar el acido nucleico.

Las proteinas no se repiten dentro de los hexones.